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附录三 全血细胞培养染色体技术常用试剂配制

一、国内实验室应用试剂配制

(一)培养液

(1)RPMI1640培养液:称取RPMI培养基9.8g,碳酸氢钠1.9g、青霉素100u/ml,加双蒸水至1000ml,调节 pH7.2~7.4无菌过滤冻存备用。

(2)小牛血清商品:成都生物制品厂。

(3)植物凝集素(PHA):自制或成品(重庆药检所)。

(4)pH调整液:5%NaHCO[XB]3[/XB]溶液高压灭菌(8磅15min),0.1N稀盐酸液100ml。

(5)秋水仙素:10mg/ml无菌过滤高压灭菌(8磅10min)。

(6)磷酸缓冲液:pH7.4。

磷酸氢二钠28.8g(H[XB]2[/XB]O)、磷酸二氢钾2.67g(无水),溶于1000ml双蒸水中,加肝素,终浓度为100u/ml。

(7)Giemsa染色液:

Giemsa粉剂 1g

甘油66ml

在研钵中,加入少量甘油油仔细研磨然后放甘油全部加磨,60℃温箱中保温2h,冷却后加入甲醇66ml。装入有色瓶中混合待用。染色时用pH7.4磷酸缓冲液稀释10倍,随配随用。

(二)固定液

(1)甲酸:冰乙酸3:1混合即用。

(2)PBS缓冲液配制:

NaCl 16gNa[XB]2[/XB]HPO[XB]4[/XB](12H[XB]2[/XB]O)5.65g

KCl 0.4g  KH[XB]2[/XB]PO[XB]4[/XB]0.4g

加双蒸水至1000ml pH7.0。

取5%胰酶(生理盐水配制)1ml加入50ml PBS液中(最终浓度为0.025%),4℃冰箱待用。

二、细胞培养(Bhatl B和McGee JOD,1990)

1.完全培养基

RPMI76.0ml

胎牛血清 20.0ml

植物凝集素2.0ml

抗生素/抗菌素溶液(100×)1.0ml

L-谷氨酰胺(100×) 1.0ml

2.BudR(5’-Bromo-2-deoxyuridine,5’-溴-2-脱氧尿嘧啶)溶解10mg/ml BudR于dH[XB]2[/XB]O中,0.2μm滤膜过滤除菌,分装后-20℃储存,BudR要在柔光(弱光)下操作。

3.胸腺嘧啶(Thymidine,Thd)按250μg/ml溶解于dH[XB]2[/XB]O中,过滤后分装储存于-20℃。

4.Colcemid(Sigma)5.0μg/ml溶于dH[XB]2[/XB]O中,过滤后分装储存于-20℃。

5.KCl(0.75mol/L)溶解560mg于100ml dH[XB]2[/XB]O中,新鲜配制37℃保存。

6.固定剂甲醇冰醋酸按3:1(V/V)混合即可,现用现配,置冰上待用。

7.缺口平移试剂盒(Amersham和BRL公司)

8.生物素7-dATP(BRL)

9.糖原(BRL)

10.RNA酶A(Sigma)

(1)储备液

称取RNA酶A 1g溶于100ml醋酸钠中,置沸水中煮10min,分装后储于-20℃。

(2)工作液

用储备液按1:100稀释。

11.20×SSC

NaCl  175g

柠檬酸三钠 88g

dH[XB]2[/XB]O1000ml

固定试剂溶解后,dH[XB]2[/XB]O定容至1000ml,调pH至7.4,高压灭菌。

12.杂交液(高深度,HMmix)

去离子甲酰胺  6.0ml

100×Denhardt’s液1.0ml

50%硫酸葡聚糖 2.0ml

1%人或鲑精DNA[SB]※[/SB][SB][/SB]

20×SSC

※:临用前加入,终浓度为100~200μg/ml。

该液为高浓度杂交液, 存于4℃。

13.PBT液

BSA  5%

TristonX-100/(PBS) 0.1%

注:BSA液用前应用Whatman 3mm滤纸过滤。

14.兔抗生物素(α-生物素)单克隆抗体

用PBT液1:100稀释。

该单抗现可从英国Dako公司购得。

15.金(10~20nm)标羊抗兔二抗

用PBT液1:50稀释。

16.银溶液(Janesen)

17.Hoedst33258(Sigma)

储备液(100×)

Hoedst染料 5mg

甲醇  10ml

工作液:用2×SSC 1:100稀释储备液。