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荚膜多糖抗原分子大小测定(琼聚糖4B柱层析法)

1 试剂

1.1 琼聚糖4B凝胶。

1.20.2mol /L 氯化钠溶液,pH7.0洗脱液。

1.3 蓝色葡聚糖2000(2~4mg)加维生素B12(0.2mg),加蒸馏水1ml溶解。

2 仪器

2.1 层析柱(1.5~1.6×100cm)。

2.2 206nm波长紫外监测仪。

2.3 部分收集器及试管。

2.4 凝胶和洗脱液储瓶,适宜的控制装置和记录器。

3 操作

3.1 琼聚糖4B凝胶的漂洗

取琼聚糖4B凝胶约300ml,加0.2mol /L 氯化钠溶液500ml,充分搅拌,静置1~2小时,倾去上层液体和悬浮于其中的细小颗粒,重复上述操作数次后至上层液体无细小颗粒,置真空罐内,抽去凝胶中的空气。

3.2 装柱

将洗好的琼聚糖4B凝胶慢慢注入柱中,避免夹杂气泡,装至约90cm,调整流速为10~12ml /小时,流洗2天。

3.3 标定

空流体积(Vo)及柱床总体积(Vi)

取蓝色葡聚糖及维生素B12溶液1ml,加于已平衡的柱上,以0.2mol /L 氯化钠溶液流洗,用部分收集器收集各组分,流速为10~12ml /小时,每管2~4ml,同时于206nm波长下自动监测,记录流洗液图谱。第一峰为蓝色葡聚糖峰,计算由加样起至第一峰峰顶的流洗液体积,即为Vo。第二峰为维生素B12峰,计算由加样起至第二峰峰顶的流洗液体积,即为Vi。

3.4 多糖抗原Kd值的测定

3.4.1 取约1ml样品(含多糖抗原3~5mg,冻干样品可用1.2项溶液溶解)。加于已标定的琼聚糖4B胶柱上,用0.2mol /L 氯化钠溶液流洗,流洗液用量为柱床总体积的1.5倍,每管收集2~4ml,同时于206nm波长下自动监测,记录流洗液图谱,由加样起至多糖峰峰顶流洗体积为Ve,计算分配系数(Kd)。

Kd=Ve―Vo/Vi―Vo

3.4.2Kd≤0.5多糖抗原回收率的计算

用求积仪分别计算Kd值0.5以前组分峰的面积除以所有组分峰的面积,即得Kd≤0.5多糖抗原回收率。

Kd≤0.5多糖回收率(%)=Kd0.5以前组分峰的面积/所有组分峰的总面积×100

注意:过柱操作在10~20℃下进行。