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附录1 人凝血因子Ⅷ效价测定(一步法)

1 试剂

1.1样品稀释液:取1容积的3.8%枸橼酸钠液加入5容积咪唑缓冲液。

1.1.1 咪唑缓冲液

称0.68g咪唑和1.17g氯化钠溶于100ml蒸馏水中,加入42.2ml 0.1mol/L盐酸,然后被 加入蒸馏水至200ml,pH为7.3。

1.1.23.8%枸橼酸钠溶液

称9.5g枸橼酸钠溶解于250ml蒸馏水中。

1.2 血小板代用品“兔(人)脑组织的氯仿抽提液”。用前用生理盐水稀释至适当倍数。

1.3白陶土生理盐水混悬液

称0.5g白陶土加生理盐水至100ml即可使用。

1.4 基质血浆

取人凝血因子Ⅷ含量低于2%的血友病病人血浆或人工基质血浆,然后分装于5ml安瓿,冻干或-30℃保存。

1.50.05mol/L氯化钙溶液

称111g氯化钙溶于1000ml蒸馏水中,配制成1mol/L氯化钙贮存液,用前进行20倍稀释,配成0.05mol/L氯化钙溶液。

1.6 人凝血因子Ⅷ标准品及标准血浆

人凝血因子Ⅷ国家标准品或经国家标准品标化的工作标准(定量分装冻干,置-30℃保存,一般2IU/ml左右),用前取样品稀释液溶解成1IU/ml。

标准血浆系取30份新鲜正常人血浆等量混合后,分装于小瓶内,置-30℃保存。自采血后至分浆冻结整个过程不得超过4小时。

1.7待测样品

按标示量加入注射用水溶解,测定时稀释成1IU/ml。

2 测定

2.1取2支试管,每管加入0.1ml基质血浆和0.1ml样品稀释液,混匀,再加0.1ml血小板代用品和0.1ml白陶土悬液,混匀,将试管置37℃水浴保温一定时间(一般2~6分钟),然后加入0.1ml0.05mol/L氯化钙溶液,记录凝固时间,2管平均值为基质血浆的“空白”值(一般应大于3分钟)。

2.2 标准品或标准血浆

用样品稀释液分别进行10倍、20倍、40倍、100倍和200倍稀释,用不同稀释浓度标准品代替2.1项试验中样品稀释液,按上述方法分别测定凝固时间。

2.3 待测样品稀释成约0.02~0.04IU/ml,代替2.1项试验中样品稀释液,同时分别测定凝固时间。

2.4测定时要求每个稀释度平行测定2管,两管之差不得超过均值10%,否则重测。

3 计算

将标准品5个不同稀释度所含人凝血因子Ⅷ单位(IU/ml),分别取其对数值,再将其各相应浓度所测得凝固时间(秒),也分别取对数值,然后按照统计学方法作直线回归方程。

方程式:log y=b olg x+a

其中x代表人凝血固子Ⅷ单位数,y代表测得相应凝固时间(秒)。

将测试样品所得到凝固时间(秒)代入方程式计算x值。然后将所得x值乘以样品稀释的倍数,即为每ml中人凝血因子Ⅷ含量。