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第二节 外界因素对细菌的影响

细菌在自然界必然不断经受周围环境中各种因素的影响。当环境适宜时,细菌能进行正常的新陈代谢而生长繁殖;若环境条件变化,可引起细菌的代谢和其他性状发生变异;若环境条件改变剧烈,可使细菌生长受到抑制或导致死亡。因此掌握微生物对周围环境的依赖关系,在医疗实践中,一方面可创造有利条件,促进微生物的生长繁殖,从病理材料中分离培养病原微生物,有助于传染病的诊断以及制备疫苗,来预防某些传染病;另一方面,也可利用环境对细菌不利因素,抑制或杀灭病原微生物,以达到消毒灭菌的目的。本节重点介绍外界环境对细菌不利因素,提高对消毒灭菌的认识以便在实际工作中加以应用。

消毒(Disinfection)杀灭病原微生物的方法。用以消毒的药物称为消毒剂(Disinfectants)一般消毒剂在常用浓度下,只对细菌繁殖体有效。对于芽胞则需要提高消毒剂的浓度和延长作用的时间。

灭菌(Sterilization)杀灭物体上所有的微生物(包括病原体和非病原体的繁殖体和芽胞)的方法。因此,灭菌比消毒的要求高;但在日常生活中,消毒和灭菌这两个术语往往通用。

无菌(Asepsis)物体上或容器内无活菌存在的意思。无菌操作是防止微生物进入机体或其他物品的操作技术。例如,进行外科手术或微生物学实验时,须注意无菌操作。

防腐(Antisepsis)防止或抑制微生物生长繁殖的方法。用于防腐的化学药物称为防腐剂。许多药物在低浓度时只有 抑菌作用,浓度增高或延长作用时间,则有杀菌作用。

消毒与灭菌技术的选择,取决于多种因素。在实际工作中应根据消毒灭菌的对象和目的要求不同,以及条件的不同,选择不同的合适方法。

一、物理因素

各种物理因素对细菌都能产生一定的影响作用。

(一)热力灭菌

高温对细菌有明显的致死作用。热力灭菌主要是利用高温使菌体变性或凝固,酶失去活性,而使细菌死亡。但是,更细微的变化已发生于细菌凝固之前。有人认为DNA单螺旋的断裂可能是主要的致死因素。细菌蛋白质、核酸等化学结构是由氢键连接的,而氢键是较弱的化学键,当菌体受热时,氢键遭到破坏,蛋白质、核酸、酶等结构也随之被破坏,失去其生物学活性,与细菌致死有关。此外,高温亦可导致胞膜功能损伤而使小分子物质以及降解的核糖体漏出。干热的致死作用与湿热不尽相同,一般属于蛋白变性、氧化作用受损和电解质水平增高的毒力效应。

热力灭菌时最可靠而普遍应用的灭菌法,包括湿热灭菌和干热灭菌法。

1.湿热灭菌法

在同样的温度下,温热的杀菌效果比干热好,其原因有:①蛋白质凝固所需的温度与其含水量有关,含水量愈大,发生凝固所需的温度愈低。湿热灭菌的菌体蛋白质吸收水分,因较大同一温度的干热空气中易于凝固。②温热灭菌过程中蒸气放出大量潜热,加速提高湿度。因而湿热灭菌比干热所要温度低,如在同一温度下,则湿热灭菌所需时间比干热短。③湿热的穿透力比干热大,使深部也能达到灭菌温度,故湿热比干热收效好。

湿热灭菌法包括有:

(1)煮沸法:煮沸100℃,5分钟,能杀死一般细菌的繁殖体。许多芽胞需经煮潮5~6小时才死亡。水中加入2%碳酸钠,可提高其沸点达105℃。既可促进芽胞的杀灭,又能防止金属器皿生锈。煮沸法可用于饮水和一般器械(刀剪、注射器等)的消毒。

(2)流通蒸汽灭菌法:利用100℃左右的水蒸汽进行消毒,一般采用流通蒸汽灭菌器(其原理相当于我国的蒸笼),加热15到39分钟,可杀死细菌繁殖体。消毒物品的包装不宜过大、过紧以利于蒸汽穿透。

(3)间歇灭菌法:利用反复多次的流通蒸汽,以达到灭菌的目的。一般用流通蒸汽灭菌器,100℃加热15~30分钟,可杀死其中的繁殖体;但芽胞尚有残存。取出后放37℃孵箱过夜,使芽胞发育成繁殖体,次日再蒸一次,如此连续三次以上。本法适用于不耐高温的营养物(如血清培养基)的灭菌。

(4)巴氏消毒法(Pasteurization):利用热力杀死液体中的病原菌或一般的杂菌,同时不致严重损害其质量的消耗方法。由巴斯德创用以消毒酒精类,故名。加温61.1~62.8℃半小时,或71.7℃15~30秒钟。常用于消毒牛奶和酒类等。

(5)高压蒸汽灭菌法:压力蒸汽灭菌是在专门的压力蒸汽灭菌器中进行的,是热力灭菌中使用最普遍、效果最可靠的一种方法。其优点是穿透力强,灭菌效果可靠,能杀灭所有微生物。

目前使用的压力灭菌器可分为两类:下排气式压力灭菌器和预真空压力灭菌器。适用于耐高温、耐水物品的灭菌。

2.干热灭菌法

干热灭菌比湿热灭菌需要更高的温度与较长的时间。

(1)干烤:利用干烤箱,加热160~180℃2小时,可杀死一切微生物,包括芽胞菌。主要用于玻璃器皿、瓷器等的灭菌。

(2)烧灼和焚烧:烧灼是直接用火焰杀死微生物,适用于微生物实验室的接种针等不怕热的金属器材的灭菌。焚烧是彻底的消毒方法,但只限于处理废弃的污染物品,如无用的衣物、纸张、垃圾等。焚烧应在专用的焚烧炉内进行。

(3) 红外线:红外线辐射是一种0.77~1000微米波长的电磁波,有较好的热效应,尤以1~10微米波长的热效应最强。亦被认为一种干热灭菌。红外线由红外线灯泡产生,不需要经空气传导,所以加热速度快,但热效应只能在照射到的表面产生,因此不能使一个物体的前后左右均匀加热。红外线的杀菌作用与干热相似,利用红外线烤箱灭菌的所需温度和时间亦同于干烤。多用于医疗器械的灭菌。

人受红外线照射较长会感觉眼睛疲劳及头疼;长期照射会造成眼内损伤。因此,工作人至少应戴能防红外线伤害的防护镜。

(4)微波:微波是一种波长为1毫米到1米左右的电磁波,频率较高,可穿透玻璃、塑料薄膜与陶瓷等物质,但不能穿透金属表面。微波能使介质内杂乱无章的极性分子在微波场的作用下,按波的频率往返运动,互相冲撞和磨擦而产生热,介质的温度可随之升高,因而在较低的温度下能起到消毒作用。一般认为其杀菌机理除热效应以外,还有电磁共振效应,场致力效应等的作用。消毒中常用的微波有2450MHZ与915MHZ两种。微波照射多用于食品加工。在医院中可用于检验室用品、非金属器械、无菌病室的食品食具、药杯及其它用品的消毒。

微波长期照射可引起眼睛的晶状混浊、睾丸损伤和神经功能紊乱等全身性反应,因此必须关好门后才开始操作。

(二)电磁波与射线

1.日光与紫与外

日光是有效的天然杀菌法,对大多数微生物均有损害作用,直射杀菌效果尤佳,其主要的作用因素为紫外线,此外,热与氧气起辅助作用。但光线效应受很多因素的影响,如烟尘笼罩的空气、玻璃及有机物等都能减弱日光的杀菌力。

紫外线是一种低能量的电磁辐射,波长范围为240~280nm,最适的波长为260nm,这与DNA吸收光谱范围相一致。其杀菌原理是紫外线易被核蛋白吸收,使DNA的同一条螺旋体上相邻的碱基形成胸腺嘧啶二聚体,从而干拢DNA的复制,导致细菌死亡或变异。紫外线的穿透能力弱,不能通过普通玻璃、尘埃,只能用于消毒物体表面及空气、手术室、无菌操作实验室及烧伤病房,亦可用于不耐热物品表面消毒。杀菌波长的紫外线对人体皮肤、眼睛均有损伤作用,使用时应注意防护。

2.电离辐射

包括高速电子、X线和r线等。具有较高的能量与穿透力,可在常温下对不耐热的物品灭菌,故又称“冷灭菌”。其机理在于产生游离基,破坏DNA。可用于消毒不耐热的塑料注射器和导管等;亦能用于食品消毒而不破坏其营养成份。

(三)滤过除菌法

将液体或空气通过含有微细小孔的滤器,只允许小于孔径的物体如液体和空气通过,大于孔径的的物体不能通过。主要用于一些不耐热的血清、毒素、抗生素、药液、空气等除菌。一般不能除去病毒、支原体和细菌的L型。滤器的种类很多常用的有:

滤膜滤器(Membrane filter)由硝基纤维素制成薄膜,装于滤器上,其孔径大小不一,常用于除菌的为0.22um。硝基纤维素的优点是本身不带电荷,故当液体滤过后,其中有效成分丧失较少。

蔡氏滤器(Seitz)是用金属制成,中间夹石棉滤板,按石棉K、EK、EK-S三种,常用EK号除菌。

玻璃滤器是用玻璃细砂加热压成小碟,嵌于玻璃漏斗中一般为G1、G2、G3、G4、G5、G6六种,G5、G6可阻止细菌通过。

实验室等处应用的超净工作台,就是利用过滤除菌的原理去除进入工作台空气中的细菌。

(四)超声与超声波(Ultrasonic and sonic waves)

每秒钟超过200,000次振动的声波不被人耳感受,称为超声波。微生物对强度高的超声波很敏感。其中以革兰氏阴性菌最敏感,而葡萄球抵抗最强。虽然声波强烈地振动可使菌群死亡,但往往有残存者。因此,这种方法在消毒灭菌方面无实用价值。主要用以裂解细胞分离提取细胞组分或制备抗原。超声波灭菌的机理尚不清楚,可能是细菌外表受细微气泡的作用,扰乱细胞内容物及破坏细胞壁致细菌崩解而死亡。

(五)干燥

多数细菌的繁殖体在空气中干燥时很快死亡,例如脑膜炎双球菌、淋球菌、霍乱弧菌、梅毒螺旋体等。有些细菌抗干燥力较强,尤其有蛋白质等物质保护时。例如溶血性链球菌在尘埃中存活25日,结核杆菌在干痰中数月不死。芽胞抵抗力更强,例如炭疽杆菌耐干燥20余年。干燥法常用于保存食物。浓盐或糖渍食品,可使细菌体内水分逸出,造成生理性干燥,使细菌的生命活动停止。

(六)低温

多数细菌耐低温。在低温状态下,这些细菌的代谢减慢,当温度如回升到适宜范围又能恢复生长繁殖,故低温常用作保存菌种。

二、化学因素

化学药物能影响细菌的化学组成、物理结构和生理活动,从而发挥防腐,消毒,甚至灭菌的作用。防腐剂的浓度高或作用时间长,也可达到消毒的目的。消毒及防腐药物对人体组织有害,只能外用或用于环境消毒。

(一)化学消毒剂

1.化学消毒剂的种类

化学消毒剂的种类很多,其杀菌作用亦不尽相同。一般可根据用途与消毒剂的特点选择使用(见表4-2)

表4-2 消毒剂种类、性质与用途

类别名称主要性状用法用途
重金属盐类升 汞杀菌作用强,腐蚀金属器械0.05~0.1%溶液非金属器皿消毒
红 汞抑菌力弱,无刺激性2%水溶解皮肤粘膜,小创伤消毒
硫柳汞杀菌力弱,抑菌力强,不沉淀蛋白质0.01%溶液

0.1%溶液

生物制品防腐皮肤、手术部位消毒
硝酸苯汞同硫柳汞,难溶于水先配成1/1500高压灭菌,衡释至0.002%生物制口防腐
硝酸银有腐蚀性1%溶液新生儿滴眼,预防淋球菌感染眼及尿道粘膜消毒
蛋白银银有机化合物1~5%溶液
弱蛋白银 10~20溶液
氧化剂高锰酸钾弱氧化剂,稳定0.1%皮肤,尿道消毒,蔬菜,水果消毒
过氧化氢新生氧杀菌,不稳定3%口腔粘膜消毒
过氧乙酸20%市售品无爆炸然危险,性质不稳定,原液对皮肤、金属有强烈腐蚀性0.2~0.5%塑料,玻璃,人造纤维消毒,皮肤消毒(洗手)

卤素及其化合物氯气刺激性强,有毒0.2~0.5ppm饮水及游泳池消毒
漂白粉白色粉末,有效氯易挥发,有氯味,腐蚀金属,棉织品,刺激皮肤,晚易潮解乳状液:10~20%乳液澄清液:乳状液放24小时后,取上清液乳状液:地面,厕所物消毒空气,物品表面(0.5~1%喷雾)
漂粉精白色结晶,有氯味,含氯较稳定0.5~1.5%一担水加10%10ml饮水消毒地面,墙壁,家具消毒,饮水消毒:0.3~0.4kg/kg
氯胺白色结晶,有氯味,杀菌力较弱,可持久,腐蚀作用小0.2~0.5%水溶液室内空气及表面消毒(喷雾)0.1~0.2%浸泡衣服
二氯异氯
尿酸钠
白色粉末,有氯味,杀菌力强,较稳定,含有效氯62~64%4ppm
3%
消毒水
消毒空气(喷雾)
排泻物,分泌物等
碘酒刺激皮肤,不能与红汞同用2.5%碘酒(酊)皮肤消毒
醇类乙醇消毒力不强,对芽胞无效70~75%溶液皮肤,体温表消毒

甲醛溶液挥发慢,刺激性强,浸泡物体表面消毒10%溶液浸泡,物品表面消毒.蒸汽消毒:10%溶液加等量水,蒸发,密闭房间6~24h,或加斗量高锰酸钾,产生黄色浓烟,消毒房间
戊二醛挥发慢,刺激性小,碱性溶液,有强大杀菌作用0.3%NaHCO3调整PH至7.5~8.5,配成2%水溶液消毒不能用热力灭菌的物品(如精密仪器)

石炭酸
来 苏
溶液杀菌力强,有特殊气味3~5%地面、家具、器皿表面消毒,2%皮肤消毒
表面活性剂新洁尔灭易溶于水,刺激性小,稳定,对芽胞无效;遇肥皂或其他合成洗涤剂效果减弱0.05~0.1%外科洗手及皮肤粘膜消毒;浸泡手术器械
杜灭芬稳定,易溶于水,遇肥皂或其他洗涤剂效果减弱0.05~0.1%皮肤创伤冲洗;金属器械,棉织品、塑料、橡皮类物品消毒
己烷洗必泰白色结晶,稳定.略溶于水,溶于醇.应用其盐类,与升汞配伍禁忌0.02~0.05%水溶液术前洗手(浸泡5分钟),腹腔、膀胱等内脏冲洗
烷基化合物环氧已烷常温下无色气体,沸点10.4℃,易燥易燃、有毒(100~200ppm对人能致死)50mg/1000ml密闭塑料袋手术器械、敷料等消
毒灭菌
染料龙胆紫溶于酒精,有抑菌作用,对葡萄球菌作用强2~4%水溶液,浅表创伤消毒
酸碱类醋酸
生石灰
浓烈醋味
杀菌力强,腐蚀性大
5~10ml/m3加等量水蒸发
加水1:4或1:8配成糊状
消毒房间,控制呼吸道感染
消毒排泄物及地面

2.化学消毒剂的作用机制

不同的化学消毒剂其作用原理也不完全相同,大致归纳为三个方面。一种化学消毒剂对细菌的影响常以其中一方面为主,兼有其他方面的作用。

(1)改变细胞膜通透性 表面活性剂(Surface-active agent)、酚类及醇类可导致胞浆膜结构紊乱并干扰其正常功能。使小分子代谢物质溢出胞外,影响细胞传递活性和能量代谢。甚至引起细胞破裂。

(2)蛋白变性或凝固酸、碱和醇类等有机溶剂可改变蛋白构型而拢乱多肽链的折叠方式,造成蛋白变性。如乙醇、大多数重金属盐、氧化剂、醛类、染料和酸碱等。

(3)改变蛋白与核酸功能基团的因子作用于细菌胞内酶的功能基(如SH基)而改变或抑制其活性。如某些氧化剂和重金属盐类能与细菌的-SH基结合并使之失去活性。

3.影响消毒剂作用的因素

(1)消毒剂的性质、浓度与作用时间各种消毒剂的理化性质不同,对微生物的作用大小也差异。例如表面活性剂对革兰氏阳性菌的灭菌效果比对革兰氏阴性菌好,龙胆紫对葡萄球菌的效果特别强。

同一种消毒剂的浓度不同,其消毒效果也不一样。大多数消毒剂在高浓度时起杀菌作用,低浓度时则只有抑菌作用。在一定浓度下,消毒剂对某种细菌的作用时间越长,其效果也越强。若温度升高,则化学物质的活化分子增多,分子运动速度增加使化学反应加速,消毒所需要的时间可以缩短。

(2)微生物的污染程度微生物污染程度越严重,消毒就越困难,因为微生物彼此重叠,加强了机械保护作用。所以在处理污染严重的物品时,必须加大消毒剂浓度,或延长消毒作用的时间。

(3)微生物的种类和生活状态不同的细菌对消毒剂的抵抗力不同,细菌芽胞的抵抗力最强,幼龄菌比老龄菌敏感。

(4)环境因素当细菌和有机物特别是蛋白质混在一起时,某些消毒剂的杀菌效果可受到明显影响。因此在消毒皮肤及器械前应先清洁再消毒。

(5)温度、湿度、酸碱度消毒速度一般随温度的升高而加快,所以温度越高消毒效果越好。湿度对许多气体消毒剂有影响。酸碱度的变化可影响剂杀灭微生物的作用。例如,季胺盐类化合物的戊二醛药物在碱性环境中杀灭微生物效果较好;酚类和次氯酸盐药剂则在酸性条件下杀灭微生物的作用较强。

(6)化学拮抗物阴离子表面活性剂可降低季胺盐类和洗比泰的消毒作用,因此不能将新洁尔灭等消毒剂与肥皂、阴离子洗涤剂合用。次氯酸盐和过氧乙酸会被硫代硫酸钠中和,金属离子的存在对消毒效果也有一定影响,可降低或增加消毒作用。

(二)防腐剂

用于防腐的药物称为防腐剂。生物制剂(如疫苗、类毒素、抗毒素等)中常加入防腐剂,以防止杂菌生长。常用防腐剂有0.5%石炭酸、0.01%硫柳汞和0.1~0.2%甲醛等。

(三)化学疗剂

用于治疗由微生物或寄生虫所引起疾病的化学药物,称为化学治疗剂,化学治疗剂具有选择性毒性作用,能在体内抑制微生物的生长繁殖或使其死亡,对人体细胞一般毒性较小,可以口服、注射。化学治疗剂的种类很多,常用的有磺胺类、呋喃类和异烟肼等。

三、生物因素的影响

(一)噬菌体(Bacteriophage)

噬菌体是能感染细菌、放线菌、真菌、螺旋体的病毒。噬菌体分布广泛,凡是有细菌存在的场所,就可能有相应噬菌体的存在。噬菌体有严格的宿主特异性,只寄居于易感宿主菌体内。

在电镜下噬菌体有三种外形,蝌蚪形、微球形和线形。大多数噬菌体呈蜊蚪形,由头部和尾部两部分组成(图4-1)。但也有无尾的噬菌体。较大的噬菌体头部的形状常为六棱柱体,头部含有核酸,外围绕一层蛋白质外壳。少数噬菌体还具有包膜。噬菌体的尾部为噬菌体与细菌接触的器官。不同的噬菌体尾部结构差异很大。噬菌体的化学成份仅含蛋白质及一种核酸,大部分噬菌体的核酸是DNA。噬菌体对理化因素的抵抗力较强。

大肠杆菌T2噬菌体结构模式图

图4-1 大肠杆菌T2噬菌体结构模式图

1.噬菌体和宿主菌细胞的关系

噬菌体感染细菌时,先通过尾刺或尾丝等特异地吸附到敏感细菌表面相应受体上,当噬菌体的尾插入细菌体时,借助于尾部含有的一种溶菌酶类物质,将胞壁溶一小孔使尾鞘插入,噬菌体的核酸很快从尾部注入细菌细胞,而致细菌发生感染。细菌感染后可出现菌体裂解或形成溶源性细菌两种结果(图4-2)。

噬菌体与细菌的相互作用(噬菌体-宿主生活周期)示意图

图4-2 噬菌体与细菌的相互作用(噬菌体-宿主生活周期)示意图

噬菌体核酸进入细胞浆后,宿主细胞即停止合成细菌自身的DNA,转而按噬菌体DNA所提供的遗传信息合成新的蛋白质,包括一些合成噬菌体DNA所需的酶及噬菌体头、尾部蛋白质亚单位等。当噬菌体DNA和蛋白质分别合成以后,在细菌胞浆内装配成为完整的成熟噬菌全。当它们增殖到一定程度,菌细胞发生裂解,释放出游离的噬菌体。噬菌体进入细菌细胞后,能在敏感宿主菌内复制增殖并使之裂解的噬菌体称为毒性噬菌体(Virulent phage)。

有些噬菌体不在敏感细菌内增殖,其基因整合于细菌基因组中,成为细菌DNA的一部分,当细菌分裂时,噬菌体的基因亦随着分布至两个子代细菌的基因中。这种噬菌体称为溶源性噬菌体(Lysogenic phage)或温和噬菌体(Temperat phage)。整合在细菌DNA上的噬菌体基因称为前噬菌体(Prophage),带有前噬菌体的细菌称为溶源性细菌(Lysogeneic bacteria)。

溶源性噬菌体能正常繁殖,但这种带噬菌体的溶源状态有时能自发终止,结果导致噬菌体增殖而引起细菌裂解。用紫外线照射或过氧化氢等处理溶源性细菌,可诱导前噬菌体从细菌的DNA分开,而开始其溶菌性周期。偶尔溶源性细菌也可失去前噬菌体。

2.噬菌体在医学和生物学中的应用

(1)细菌的鉴定与分型噬菌体的作用具有高度特异性。一种噬菌体只能裂解一种或与该种相近的细菌,故可用于细菌的鉴定和分型。目前已利用噬菌体将金黄色葡萄球菌分为四个群数百个型,这种用噬菌体分型的方法,在流行病学调查上,对追查和分析这些细菌性感染的传染源很有帮助。

(2)检测标本中的细菌应用噬菌体效价增长试验检查标本中的相应细菌,若在检材中检出某种噬菌体时,常提示有相应细菌存在。

(3)分子生物学研究的重要工具噬菌体基因数量少,有些噬菌体为某种遗传基因缺陷株,有些噬菌体经人工诱导的变异和遗传容易控制和辩认,并且可用于基因的转导和变换等研究。近年来,噬菌体已成为遗传研究中的主要的基因载体工具。

(二)抗生素(Antibiotic)

某些微生物在代谢过程中产生的,能抑制或杀灭其他微生物的一种化学物质。抗生素主要来源于放线菌、某些真菌和细菌。目前生产的抗生素,除从微生物培养液中提取外,有些已能人工合成或半合成。

抗生素的作用主要干扰病原微生物的代谢过程,从而起到抑菌或杀菌作用。抗生素的作用原理大体可概括以下方式:(1)抑制细菌细胞壁的合成(如青霉素);(2)影响细菌细胞膜的通透性(如多粘菌素);(3)抑制菌体蛋白质的合成(如氯霉素、四环素);(4)抑制细菌核酸合成(如灰黄霉素)。

(三)细菌素(Bacteriocin)

是某些细菌产生的一类抗菌物质,作用谱窄,因而治疗应用价值不大。目前认为有一定应用价值的,只是在细菌的分型及流行病学的调查上。