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第五节 自然杀伤细胞的检测

NK细胞表面至少存在CD2、CD11b、CD11c、CD16、CD56和CD69等多种抗原,但均非NK细胞所特有,因此现今极少以CD系列抗原为指标鉴定和计数NK细胞,而多检测NK细胞活性。NK细胞株作为靶细胞,而测小鼠NK细胞活性则用YAC细胞株,检测方法多种多样,各有其优缺点。

(一)形态法

检测原则是将效应细胞与靶按一定比例混合共育,继而台盼蓝或伊红Y等活细胞拒染的染料处理,然后分别计数着染的死细胞和不着染的活细胞,由此推算NK的细胞的杀伤活性。本法简便,易于掌握,但判断死细胞与活细胞不免带有检测者的主观因素,也无法计数轻微损伤的细胞。

(二)酶释法

检测原则是将一定比例的效应细胞和靶细胞共温一段时间后,离心沉淀,取上清液检测靶细胞遭破坏后释放的乳酸脱氢酶或碱性磷酸酶含量。本法经济、快速简便,但可定量。缺点是靶细胞内碱性磷酸酶含量低或因某些未死亡细胞能自行释放,从而影响法灵敏度和特异性。此外乳酸脱氢酶分子较大,仅当靶细胞膜完全被破坏时才释放,故不能较早地反映效应的功能。

(三)荧光法

检测原则是用荧光素标记靶细胞,经与效应细胞共温后,离心法上清,用荧光计检测剩余的活靶细胞的荧光,缺点是活细胞释放的荧光常被效应细胞和培养液等所粹灭。另外,荧光分析法常遇细胞自然释放率高,荧光本底强,影响灵敏度。为克服上述障碍,用时间分辨荧光免疫分析,将靶细胞用镧系元素铕(Eu[SB]3+[/SB])的螯合物标记,按同法与效应细胞共温后,用时间分辨荧光计检测荧光,可除去非特异性荧光本底。本法实验时间短,效靶细胞仅需共温2h,检测速度快,特异性强。

检测原则是将效应细胞和靶细胞按一定比例混合温育后,直接检测靶细胞。分有靶细胞浆释放法和胞核释放法。

1.胞浆释放法常用[SB]51[/SB]Cr释放法。[SB]51[/SB]Cr透过细胞膜与胞浆中小分子蛋白质结合,一旦细胞膜遭破坏,同位素随蛋白质外溢,并且不会被完整的细胞再度摄入。本法操作简便快速能定量,缺点是自然释放率高,所需靶细胞数量多,[SB]51[/SB]Cr半衰期短。近年有用[SB]111[/SB]In(铟)检测NK细胞活性,优点是标记率高,用量微,以γ射线放射,可释放90%的自身能量,比[SB]51[/SB]Cr高10倍,自然释放率低,仅为[SB]51[/SB]Cr的一半。

2.胞核释放法常用[SB]3[/SB]H-TdR或[SB]125[/SB]IudR作为DNA合成的前体物,可被摄入靶细胞核内。当效应细胞和靶细胞共温后,用胰酸和DNA酶处理可使遭破坏的胞核内容物释放。本法自然释放率比[SB]51[/SB]Cr低,半衰期较长,方法的敏感性高,故被大多数实验室所采用。

(五)化学发光法

检测原则是当效应细胞与靶细胞接触时,效应细胞呼吸爆发,生成极不稳定的O[XB]2[/XB][SB]-[/SB]和OH[SB]-[/SB]等,放出光子,在发光剂存在的条件下,可被电倍增管接受和计数,发光量与NK细胞杀伤能力相关。

总之,检测NK细胞活性的方法多种多样,方法的简繁有很大差异,但敏感性和特异性亦异,从简单的活细胞计数直至最先进的流式细胞仪分析,一般可根据实验要求和具体条件选用。