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第二节 抗血清的制备

一、动物的选择

选择合适的动物进行免疫极为重要。选择时应考虑以直几个因素:①抗原与免疫动物的种属差异越远越好;亲缘关系太近不易产生抗体应答(如兔-大鼠之间,鸡-鸭之间)。②抗血清量的需要:大动物如马、骡等可获得大量血清(一头成年马反复采血可获得10000ml以上的抗血清);但有时抗体需要是不多,选用家兔或豚鼠即可。③抗血清的要求:抗血清可分为R型和H型。H型抗血清用于沉淀反应较难掌握,因而极少应用。④抗原的选择:对蛋白质抗原,大部分动物皆适合常用的是山羊和家兔。但是,在某些动物体内有类似的物质或其它原因,对这些动物免疫原性极差,如IgE对绵羊、胰岛素对家兔、多种酶类(如胃蛋白酶原等)对山羊等,免疫时皆不易出现抗体。这些物质有时可以用豚鼠(如胰岛素等)、火鸡、甚至猪、狗、猫等作试验免疫。⑤甾体激素免疫多用家兔;酶类免疫多用豚鼠。

二、免疫剂量、时间和途径

免疫原合适剂量的选定应考虑抗原性强弱、分子量大小和免疫时间。抗原需可量多,时间间隔长,剂量可适当加大。大动物抗原剂量(以蛋白抗原为准)约0.5~1mg/只,小动物约0.1~0.6mg/只。有时主观希望加强免疫效果而不适当地加大剂量,往往会弄巧成拙。因为剂量加大极易造成免疫耐受(免疫抑制)而遭失败。已有证明,几微克的蛋白质也能很好地免疫出抗血清。

免疫注射的途径也很重要。一般采用多点注射,一只动物注射总数约为8~10点,包括足掌及肘窝淋巴结周围,背部两侧、颌下、耳后等处皮内或皮下,皮内易引起细胞免疫反应,对提高抗体效价有利。但皮内注射较困难,特别是天冷时更难注入(因佐剂加入后粘度较大)。其他途径还有肌内、腹腔、静脉、脑内等,但较少应用。如抗原极为宝贵可采用淋巴结内微量注射法,抗原只需10~100μg;方法是先用不完全佐剂在足作基础免疫(预免疫),10~15天后可见肘窝处有肿大的淋巴结(有时在腹股沟处触及),用两手指固定好淋巴结,消毒后用微量注射器直接注射入抗原(一般不需要佐剂)。

免疫间隔时间也是重要因素,特别是首次与第二次之间更应注意。第一次免疫后,因动物机体正处于识别抗原和B细胞增殖阶段,如很快接着第二次注入抗原,极易造成免疫抑制。一般以间隔10~20天为好。二次以后每次的间隔一般为7~10天,不能太长,以防刺激变弱,抗体效价不高。对于半抗原的免疫间隔则要求较长,有的报告1个月,有的长达40~50天,这是因为半抗原是小分子,难以刺激机体发生免疫反应之故。免疫的总次数多,多为5~8次。如为蛋白质抗原,第八次免疫未获得抗体,可在30~50天后再追加免疫一次;如仍不产生抗体,则应更换动物。半抗原需经长时间的免疫才能产生高效价抗体,有时总时间为一年以上。

三、动物采血法

动物免疫3~5天后,如抗血清鉴定合格(见下节),应在末次免疫后5~7天及时采血,否则抗体将会下降。因故未及时取血,则应补充免疫一次(肌肉、腹腔或静脉内注射,不加佐剂),过5~7天取血。

1.颈动脉放血法这是最常用的方法,对家兔、山羊等动物皆可采用。在动物颈外侧做皮肤切口,拉开皮肤后可见斜行的胸锁乳突肌,将此肌钝性分离并推向后方,即可见到淡红色有弹性的总动脉。将此动脉轻轻游离(连同与之同行的迷走神经),用丝线将远心端结扎,近心端用止血钳夹住,另一止血钳夹住动脉迷走神经,用以固定。沿结扎处剪断血管,用固定止血钳将断端放入瓶口,慢慢打开夹持的止血钳,动脉血立即喷射入瓶。如此放血的速度快,动物死亡也快,取血量略少于其他放血法。如在放血大约总量的一半时,暂时将动脉夹住片刻,再继续放血,得血量可以多些。

另外一种慢放血法是在动脉内插入一采血器,用闭式放血。在颈动脉内插入一较粗的玻璃管,将血管与玻璃管用线扎牢,玻璃管接一橡皮管引血入瓶,也极为方便。

2.心脏采血法此法多用于豚鼠、大鼠、鸡等小动物。采血技术应熟练,穿刺不准容易导致动物急性死亡。

3.静脉多次采血法家兔可用耳中央静脉,山羊可用颈静脉。这种放血法可隔日一次,有时可采集多量血液。如用耳静脉切开法,一只家兔可采百余毫升血液(用颈动脉放血最多可获70~80ml,一般只有50ml左右)。用颈静脉采集绵羊血,一次可放300ml,放血后立即回输10%葡萄糖盐水,三天后仍可采血200~300ml。动物休息一周,再加强免疫一次,又可采血二次。如此,一只羊可获1500~2000ml血液。小鼠取血往往采取断尾或摘除眼球法,每鼠得血一般不超过2ml。

抗血清的分离多采用室温自然凝固,然后放置37℃或4℃待凝块收缩。前者迅速,但得血清较少;后者时间长,有时还会出现溶血,但获得血清多,而且效价不会下跌。

抗血清分出后是否要经56℃30min灭活有两种不同意见。一种认为血清中有许多活性酶,特别是球蛋白的降解酶,如不清除,血清存放过程中将导致抗体效价下降。另外的意见认为,这种自然降解是微不足道的,56加温后,有些球蛋白会发生热变性或者热聚合。含这种聚合大分子蛋白的抗血清用于免疫浊度试验时,可因沉淀剂(如PEG)的加入而发生假性混浊。